FORPRION

BAYERISCHER FORSCHUNGSVERBUND PRIONEN

LMU 9 Phänotypisierung von Prionkrankheiten mit Hilfe von GFP-PrP Chimären bei transgenen Mäusen

Arbeitsfeld:

Die kurzfristigen zellulären Prozesse und pathogenetischen Mechanismen, die zu Prionerkrankungen als Folge einer Infektion führen, sind nicht gut verstanden. Ein primäres Ziel dieses Projektes war es, Einblick zu gewinnen in diese Prozesse durch die Erzeugung von transgenen Mauslinien, die modifizierte Versionen des Prionproteins (PrP) unter der Kontrolle von authentischen Maus Prnp-Gen Promotorelementen stehen und diese Mauslinien in entsprechenden Tierversuchen einzusetzen, die die Funktion von PrP und die Pathomechanismen der Prionerkrankungen ansprechen. Der erste Typ von transgenen Mäusen, die für diesen Zweck erzeugt wurden, exprimiert ein chimäres PrP gekoppelt an das „verstärkt grün-fluoreszierende Protein“ (EGFP-PrP). Wir konnten fünf unterschiedliche Linien von transgenen Tieren erhalten, die diesen Type von Transgen tragen. Drei davon zeigen die gleiche Verteilung des EGFP-PrP Fusionsproteins in ihren Gehirnen, die auch für PrP alleine in Wildtyp-Tieren beobachtet wird. Zwei transgene Linien unterscheiden sich leicht in den beobachteten EGFP-PrP Verteilungen von dem normalen PrP-Verteilungsmuster. All diese transgenen Linien werden jetzt sowohl auf einem normalen Wildtyp-Hintergrund als auch auf einen PrP-Knockout Hintergrund gezüchtet. Tiere auf Wildtyp-Hintergrund und solche auf einem hemizygoten Wildtyp/PrP-Knockout Hintergurnd konnten schon mit Prionen des RML Stammes über die intracerebrale und die orale Route inokuliert werden. Die EGFP-PrP Linien auf dem Wildtyp Hintergrund zeigten die gleiche Scrapie-Inkubationszeit wie normale Wildtyp Tiere bei intracerebraler Infektion. In Hirnhomogenaten von terminal kranken Tieren dieser EGFP-PrP exprimierenden Linien konnten wir einen PK-resistenten PrP-Anteil des Fusionsproteins nachweisen, der darauf hindeutet, dass diese PrP-Variante zur PrPSc-Konformation umgewandelt wurde. Durch die intrinsiche Fluoreszenzmarkierung des Proteins können wir nun frühe Änderungen der Lokalisation des EGFP-PrP Fusionsproteins während der Infektion verfolgen und damit die ersten Zielzellen insbesondere während einer oralen Infektion des Verdauungstrakts identifizieren. Deshalb haben wir mit diesen transgenen Mauslinien nun ein sehr vielseitiges Instrument in der Hand, um die Prion-Pathogenese und diverse Aspekte der PrP-Funktion unter physiologischen Bedingungen im intakten Organismus zu untersuchen. Im zweiten Teil des Projekts haben wir transgene Mäuse erzeugt und untersucht, die ein PrP tragen, das an Histidinresten innerhalb seiner Kupferbindungsstellen mutiert wurde. Ein zweiter Typ von transgenen Tieren exprimiert PrP mit dem Austausch aller vier Histidinreste der Oktarepeat-Region gegen Glycine. Von den vier unterschiedlichen transgenen Linien, die wir erhalten haben, konnten zwei, die wir auf einem PrP-Knockout Hintergrund gezüchtet haben, eingesetzt werden für Infektionsstudien, die auf eine Klärung der möglichen Rolle der Interaktion von Kupfer und PrPC im infektiösen Prozess abzielten. Line HG34 hatte eine dramatisch verlängerte Scrapie-Überlebenszeit, die mehr als verdoppelt war bei einer Infektion mit dem RML-Stamm im Vergleich zu Wildtyp-Tieren. Auch die HG1 Linie zeigt eine signifikante Verlängerung der Scrapie-Überlebenszeit, allerdings weniger dramatisch. Das mutierte PrP, das diese Linien erzeugen, ist voll funktionell, da es die Neurodegeneration des „Shmerling“-Phänotyps der transgenen F35 Tiere, die eine verkürzte PrP-Version exprimieren, vollständig unterdrücken kann. Die Ergebnisse von in vitro Aggregationsversuchen mit bakteriell hergestelltem HG-PrP sowie die Differenzen in den proteolytischen Verdaumustern von PrP in Hirnhomogenaten von Scrapie-infizierten HG34-Mäuse im Vergleich zum Wildtyp , weisen auf einen möglicherweise signifikanten Einfluß der Kupferbindung (oder der Kupferbindungsstellen) auf die Pathogenese der Prionerkrankungen hin. Die Abwesenheit von intakten Kupferbindungsstellen innerhalb der Oktarepeat-Region von PrP, scheint die Krankheitsausbreitung in vivo und die Aggregation in vitro deutlich zu bremsen. Um die Rolle der Kupferbindungsstellen außerhalb des Oktarepeats zu klären, haben wir eine dritten Typ von transgenen Mäusen erzeugt, der PrP nur mit einem Austausch von Histidin 96 gegen Glycin exprimiert. Von den fünf für dieses Konstrukt erhaltenen transgenen Linien wurde eine Linie schon auf PrP-Knockout Hintergrund gezüchtet. Die Infektion dieser transgenen Tiere mit RML Scrapie hat zu der erstaunlichen Beobachtung einer dramatisch verkürzten Überlebenszeit geführt. Damit wurde die Möglichkeit aufgezeigt, das spezifische Kupferbindungsstellen innerhalb des PrP deutlich unterschiedliche Rollen beim Krankheitsfortschritt haben können.