FORGEN

FORSCHUNGSVERBUND GRUNDLAGEN GENTECHNISCHER VERFAHREN

FORGEN II VV6 Stringente Regulation von Suizidgenen in Humanzellen

Arbeitsfeld:

Arbeitsgebiet

Das Regulatorprotein des bakteriellen Tetrazyklin-Resistenzgens kann als genetischer Schalter für die Regulation der Genexpression in Säugerzellen eingesetzt werden. Es bindet an spezielle DNA-Sequenzen (tetO) und bringt somit gezielt eine gekoppelte humane Aktivator- oder Repressordomäne an das zu regulierende Gen. Handelt es sich um einen Aktivator, wird die Genexpression in der Zelle angeschaltet. Sobald das Antibiotikum Tetrazyklin zugegeben wird, kann dieser Regulator nicht mehr an tetO binden, was zum Abschalten der Genexpression führt. Aufgrund der großen Affinität von Tetrazyklin für den Regulator und dessen guter Zellgängigkeit reicht für das Abschalten der Genexpression eine für höhere Organismen völlig ungiftige Konzentration aus. In dieser Dosis zeigt Tetrazyklin keinerlei antibiotische Wirkung. Die sehr gut untersuchten pharmakologischen Eigenschaften der Tetrazykline schaffen die Voraussetzung dafür, dieses System auch in der Gentherapie anzuwenden. Als bakterielles Regulationssystem hat es gegenüber den durch Hormone regulierten Kontrollelementen den Vorteil, daß nur die mit tetO versehene, “künstliche” Genexpressionseinheit gezielt angesprochen wird.

Projektziel

Durch unsere Vorarbeiten in der FORGEN I- Förderperiode konnten wird die Regulationseigenschaften des Tetrazyklin-induzierbaren Genexpressionssystems in Humanzellen verbessern. Dies wurde durch den Einsatz einer zusätzlichen Repressorkomponente erreicht und führte zu einer deutlichen Reduktion an unspezifischer Expression des Zielgens. Mit Hilfe dieses verbesserten, stringenteren Expressionssystems wollen wir nun Suizid- bzw. Toxingene induzierbar exprimieren. D.h. nach Zusatz von Tetrazyklin soll die Produktion dieser Gene angeschaltet und dadurch ein rascher Tod der Zielzelle erreicht werden.

Projektbeschreibung

Bisher wurden zwei Regulationsstrategien entwickelt: Repression und Aktivierung. Die Komponenten beider Regulationssysteme sind eine DNA-Sequenz von wenigstens 15 Basenpaaren (tetO), das Tetrazyklin-abhängige Regulatorprotein bzw. eine gezielte Modifikation davon und der Induktor Tetrazyklin. Durch den entgegengesetzten Einsatz und die Wirkung von Aktivator bzw. Repressor wird das Zielgen ausschließlich nach dem Zusatz von Tetrazyklin produziert. Als Zielgene sollen direkt wirkende (z.B. bakterielle) Toxingene bzw. den Zelltod einleitende humane Gene verwendet werden, die rasch zum Absterben induzierter Zellen führen (siehe Abbildung). Diese Komponenten werden in humaner Zellkultur mittels unterschiedlicher Zelltypen untersucht. Der Schwerpunkt liegt dabei auf einem Vergleich von induzierten und nicht induzierten Zellen: - Sind die nicht induzierten Zellen gesund oder geschädigt' - Unterscheiden sich nicht induzierte Zellen von Kontrollzellen, die keine Suizidgene enthalten' - Wann und mit welcher Effizienz sterben die induzierten Zellen ab'

Anwendung in der Praxis:
Wirtschaftlicher Nutzen

Durch die stringente Regulation von Suizidgenen eröffnet sich die Möglichkeit, im Rahmen einer Gentherapie veränderte Zellen gezielt durch Tetrazyklingaben aus dem Organismus zu eliminieren (“Sicherheitskassetten”). Auf ähnliche Weise könnten auch Tumorzellen effizient zum Absterben gebracht werden, ohne gesunde Gewebe zu beinträchtigen. Das Projekt wird in enger Zusammenarbeit mit der BASF Pharma/ Koll AG ausgeführt.