FORGEN

FORSCHUNGSVERBUND GRUNDLAGEN GENTECHNISCHER VERFAHREN

FORGEN I LI4 Entwicklung und Evaluierung stammspezifischer Nukleinsäuresonden für bei der Entwicklung von sicheren Lebendimpfstoffen relevante Bakterien

Arbeitsfeld:

Schnelle und zuverlässige Identifizierung von Bakterien ist ein zentrales Erfordernis in allen Disziplinen der Mikrobiologie, so auch bei der Entwicklung bakterieller Lebendimpfstoffe. Während sich zur Identifizierung auf spezies- und höheren taxonomischen Ebenen spezifische Nukleinsäuresondenhybridisierung bereits als Standardtechnik durchgesetzt hat, gilt dies für die Stammidentifizierung bislang nur bedingt. Bei geeigneter Versuchsführung lassen sich einzelne Basenunterschiede erkennen. Somit ist jede bekannte Veränderungen des Erbmaterials mit diesen Techniken erfaßbar. Zur Identifizierung von Mikroorganismen auf Spezies- und höherer taxonomischer Ebene werden heute gegen ribosomale Ribonukleinsäure (rRNS) gerichtete Hybridisierungssonden verwendet. Diese rRNS-Moleküle bzw. deren Gene enthalten diagnostische Regionen für unterschiedliche taxonomische Niveaus. Allerdings sind in diesen im Laufe ihrer Evolution wenig veränderten Genen meist keine stammspezifischen Sequenzen zu finden. Im Rahmen des Forschungsvorhabens sollen stammspezifische Hybridisierungssonden für bei der Entwicklung sicherer Lebendimpfstoffe relevante Bakterien entwickelt und getestet werden. Die Konstruktion dieser Sonden soll nach verschiedenen Vorgehensweisen erfolgen. Im Falle genetisch gut untersuchter (z.B. Escherichia coli K12) Stämme sollen Sequenzen hochvariabler Gene oder Genabschnitte zur Sondenkonstruktion herangezogen werden. Durch Literatur- und Datenbankrecherchen sollen weitere Zielsequenzen in Genen oder nichtkodierenden Genomregionen gesucht werden, die diagnostisch für den betreffenden Stamm und zur Unterscheidung nahverwandter Stämme geeignet sind. Wenn gezielte Sondenkonstruktion nicht möglich ist, sollen stammspezifische DNS-Fragmente mittels Ausschlußhybridisierung gesucht werden. Hierbei werden fragmentierte Genome des Zielstammes und nahverwandter Referenzstämme hybridisiert. Die Sondentechnik bietet im Vergleich zu anderen mikro- und molekularbiologischen Verfahren zur Stammdifferenzierung klare Vorteile: Weniger experimenteller Aufwand (z.B. keine Gelelektrophorese); keine oder weniger aufwendige Nukleinsäureisolierung; keine Reinkultur erforderlich; Mischkulturen und komplexes Probenmaterial analysierbar; lateraler Gentransfer nachweisbar; hoher Probendurchsatz und gleichzeitige Identifizierung von Vektor und Wirt. Bei der Erprobung von bakteriellen Lebendimpfstoffen sollte durch spezifische in situ Hybridisierung in z.B. Biopsiematerial oder (bei oraler Applikation) Darminhalt und Fäkalien von Probanden oder Versuchstieren der Nachweis und Identifizierung einzelner Bakterienzellen erfolgen. Die derzeit erreichbaren Nachweisgrenzen erfordern allerdings ca. 1000 Zielsequenzen in der Zelle, was für rRNS-Zielsequenzen bei physiologisch aktiven Bakterien gegeben ist, jedoch nicht bei (stammspezifischen) genomischen Zielsequenzen. Günstiger ist die Situation hinsichtlich der Detektion auf mRNS lokalisierter Zielsequenzen. Die in situ Zellhybridisierungstechnik soll mit entsprechenden zu konzipierenden Sonden für mRNS des p60--Proteingens von Listeria monocytogenes erprobt und optimiert werden.