FORZEBRA

FORSCHUNGSVERBUND FüR ZELLBASIERTE REGENERATION DES MUSKULOSKELETTALEN SYSTEMS IM ALTER

4. Zelltracking von applizierten Zellen mittels SPECT/CT, PET und PET/CT durch direkte Zellmarkierung und nach Transduktion verschiedener Reportergen-Systeme im Klein- und Großtiermodell

Arbeitsfeld:

Die klassische planare Szintigrapie in der Nuklearmedizin ist heute in der molekularen Bildgebung durch die tomographischen Verfahren SPECT und PET abgelöst. Beide Verfahren sind sehr sensitiv (Detektion im nano- bis picomolaren Bereich) und können daher sehr geringe Tracermengen nachweisen. Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass die Viabilität der markierten Zellen durch die radioaktiv markierten Tracer kaum beeinträchtigt wird. Verfahren zur direkten Markierung von Zellen mit Isotopen gibt es bereits seit einiger Zeit. Zur Anwendung kommen Isotope mit relativ langen Halbwertzeiten wie etwa das seit den 80er Jahren in Europa klinisch zugelassene [111In]Indium-Oxinat für SPECT (T1/2 = 2,8 d) oder [64Cu]Kupfer-PTSM für PET (T1/2 = 12,7 h), Die Isotope werden mittels eines lipophilen Komplexbildners über die Zellmembranen in die Zelle eingeschleust und binden dann dort an intrazelluläre Proteine, während der Chelator die Zelle wieder verlässt. Praktisch inkubiert man die aufgearbeiteten Zellen mit den radioaktiven Markern und wäscht dann die Zellen mehrmals, um nicht aufgenommene Radioaktivität zu entfernen (Kircher et al, 2003). Markierungsausbeuten von bis zu 100% sind möglich, doch das hängt sehr stark von den Inkubationsbedigungen ab. Bei Verwendung von [111In]Indium-Oxinat oder [64Cu]Kupfer-PTSM sind kaum Auswirkungen auf die Viabilität oder Funktionalität der markierten Zellen beschrieben (Grimm et al, 2006; Zhou et al, 2005), dies wird jedoch für die Markierung hämatopoetischer Vorläuferzellen kontrovers diskutiert (Brenner et al, 2004; Nowak et al, 2007; Bindslev et al, 2006). Bei phagozytotischen Zellen, wie z.B. Makrophagen, ist eine direkte Markierung über ihre natürliche Aktivität natürlich leichter zu erreichen als bei nicht phagozytotisch aktiven Zellen. Ein prinzipieller und auch messtechnisch schwer zu erfassender Nachteil bei der direkten Markierung ergibt sich aus dem Fakt, dass die Zellen ihre Markierung oft über die Zeit wieder verlieren, was die Methode ungeeignet für längerfristige Beobachtungen macht (Adonai et al, 2002; Grimm et al, 2006, Zhou et al, 2005).
Eine Lösung hierfür bietet sich bei der indirekten Markierung über die Einführung von Reportergenen an. Hierfür werden die Zellen gentechnisch modifiziert, so dass sie als Genprodukt entweder ein Enzym exprimieren, das als Substrat ein Kontrastmittel nutzt (z.B. Luziferase bei der optischen Bildgebung oder HSV-Thymidinkinase bei PET-Techniken), oder aber einen Rezeptor auf der Zellmembran (z.B. den Transferrin-Rezeptor bei MR-Verfahren oder den Dopamin D2-Rezeptor bei nuklearmedizinischen Techniken), an dessen Liganden das Kontrastmittel bzw. das Radionuklid gekoppelt wird (Blasberg und Gelovani, 2002; Ponomarev et al, 2004; Tannous et al, 2006; Weissleder et al., 2000).
Dabei wird die Zelle über das Reportergenprodukt als Vermittler markiert. Idealerweise wird ein Gen gewählt, das entweder im zu untersuchenden Organismus (z.B. Luiferase) oder wenigstens im Zielgewebe nicht vorkommt. Klassische Reportergene sind die Luziferase oder GFP (für optische Bildgebung mit Bioluminesenz bzw. Fluoreszenz (Koehne et al, 2003, Ponomarev et al, 2004; Tang et al, 2003), Varianten der HSV-TK (für PET) sowie Biotin-Akzeptor-Proteine, Rezeptoren oder die Tyrosinkinase (für MRT, PET, SPECT) (Alfke et al, 2003; Rogers et al, 2006; Tannous et al, 2006). Ist die Genexpression des Reportergens in der Zelle stabil, können im Gegensatz zu einer direkten Markierung die Zellen theoretisch über einen langen Zeitraum verfolgt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass das Reportergen bei stabiler Transfektion auch an die Tochterzellen weitergegeben wird, so dass tatsächlich die Proliferation in vivo gemessen werden kann, da sich das Signal über die Zeit verstärkt. Das PET-Signal kann also auch direkt vitalen Zellen zugeschrieben werden. Weiterhin ist die Expression von Rezeptorsystemen wie z.B. das dopamnerge und das Somatostatin-Rezeptorsystem von grossem Interesse, da diese Systeme zum einen nicht in den hier betrachteten Geweben vorkommen und damit ein hohes Signal-zu-Untergrund-Verhältnis erzielt werden kann und da zum anderen in unserer Gruppe eine Vielzahl von Radioliganden für diese Systeme etabliert sind, die deutliche Affinitäts- und Subtypenspezifitäten aufzeigen und so für die jeweilige Anwendung gezielt eingesetzt werden können.
Die Einführung der Reportergene ist über verschiedene Verfahren möglich, von denen heute virale Vektoren wie beispielsweise Lentiviren am weitesten verbreitet sind (De et al, 2003). Das am häufigsten verwendete Reportergen dürfte wohl die Herpes-simplex-Thymidinkinase (HSV-TK) oder eine ihrer zahlreichen Varianten sein (Gambhir et al, 2000), die nicht natürlicherweise in eukaryontischen Zellen vorkommen. Die HSV-TK phosphoryliert ihre radioaktiven Substrate (Pyrimidin- oder Acycloguanosin-Analoga wie 124I-FIAU, 18F-FEAU oder 18F-FHBG), die daraufhin mit einer negativen Ladung versehen die Zelle nicht mehr verlassen können und somit in der transfizierten Zelle akkumulieren (ähnlich dem ’metabolic trapping’ beim FDG). Aufgrund der geringen Konzentration der Radiotracer (Mikro- bis Nanogramm-Bereich) treten hierbei keine toxischen Effekte durch die Metaboliten auf. Mittels HSV-TK und PET-Bildgebung konnte die Akkumulation tumorspezifischer Lymphozyten in vivo verfolgt (Koehne et al, 2003) sowie die Aktivierung von T-Zellen erfasst werden (Ponomarec et al, 2001).
Für das dopaminerge System sind verschiedene D2-Liganden eingesetzt worden (Aung et al, 2005) und auch der Somatostatin-Rezeptor wurde in Verbindung mit [111In]-Octreotid ebenfalls als Reportergen eingesetzt (Rogers et al, 2003). Da das Octreotid klinisch zugelassen ist, stellt dies ein vielversprechendes System für klinisches Cell Tracking dar. Ein anderes attraktives System bietet der Natrium-Iod-Symporter (NIS), dessen Expression mit [123I]Iod oder [99mTc]Technetium für SPECT- oder [124I]Iod für PET-Untersuchungen dargestellt werden kann und nur in einigen wenigen Organen exprimiert wird (Huang et al, 2001). Der NIS wurde genutzt, um die Wanderung und die Differenzierung neuraler Stammzellen zu beobachten (Kim et al, 2005) sowie zum Tracking und zur Quantifizierung von Tumorzellen (Marsee et al, 2004; Shin et al, 2004).