FORPRION

BAYERISCHER FORSCHUNGSVERBUND PRIONEN

TUM 7 Die Rolle von aktivierten Retroviren als Kofaktoren bei der prioninduzierten spongiformen Enzephalopathie: Studien mit einem Maus-Modell zur Pathogenese und Therapie

Arbeitsfeld:

Prionen werden als auslösendes Agens bei den übertragbaren spongiformen Enzephalopathien angesehen. Jedoch ist noch immer wenig über die molekularen Mechanismen der Pathogenese, die Rolle von Kofaktoren und die Interaktion von Prionproteinen mit zellulären Komponenten bekannt. In diesem Projekt verwendeten wir verschiedene Microarray-Techniken, um zelluläre Komponenten zu identifizieren, die als Folge einer Prion-Infektion eine veränderte Genregulation aufweisen. Als erstes untersuchten wir den Einfluss einer Prion-Infektion auf die Expression endogener Retroviren (ERVs) der Maus, welche insgesamt etwa 10% des Mausgenoms umfassen. Die Aktivierung endogener Retroviren kann zur Produktion retroviraler Partikel führen, die dazu benützt werden könnten, Prionproteine von Zelle zu Zelle zutransportieren und damit die Infektion zu verbreiten. Neuronale Hypothalamuszellen (GT1) und Neuroblastomzellen (N2a) können mit Maus-adaptierten Scrapie-Stämmen persistent infiziert werden. Mit einem Retrovirus-spezifischen Microarray und quantitativer PCR wurden die ERV-Expressionsprofile in Prion-infizierten, nicht infizierten und gegen die Infektion behandelten Zelllinien, sowie klonierten Zellen, untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass Prion-Infektionen die ERV-Expression in neuronalen Zellen beeinflussen, dass dieser Einfluss von der Zellinie abhängt, ERV-spezifisch ist und auf die Behandlung mit anti-Prion-Präparaten anspricht. Insbesondere Maus-Leukämieviren (MLV) und retrovirale Elemente, die intrazisternale A-Typ-Partikel (IAP-1) kodieren, waren in Prion-infizierten N2a-Zellen konsistent hochreguliert. Diese Ergebnisse werden durch die Experimente anderer Arbeitsgruppen gestützt, die zeigen konnten, dass die Koinfektion mit dem exogenen Moloney Maus-Leukämievirus (MoMLV) die Infektiosität des Überstandes Scrapie-infizierter Zellen erhöht. Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Prionen nicht nur durch virale Partikel verbreitet werden, sondern unter Umständen sogar die Produktion solcher Partikel durch Aktivierung von ERVs anregen können. Das menschliche Genom enthält etwa die gleiche Menge an retroviralen Sequenzen wie das Mausgenom. Obwohl diese Sequenzen weitaus weniger aktiv sind als murine endogene Retroviren, können einige von ihnen retrovirusähnliche Partikel produzieren oder retrovirale Hüllproteine exprimieren, die den Zell zu Zell Kontakt vermitteln und auf diese Weise zur Ausbreitung von Prionen beitragen können. In einem weiteren Ansatz haben wir GT1- und N2a-Zellen, sowie einen N2a-Zellklon, der mit dem Maus-adaptierten Prionstamm 22L frisch infiziert und als Negativkontolle mit einem nicht infektiösen Gehirnhomogenat behandelt worden war, verwendet, um zelluläre Gene der Maus zu identifizieren, die durch eine Prion-Infektion beeinflusst werden. Mit Hilfe eines Maus-spezifischen cDNA Microarrays, der Sequenzen von ungefähr 21.000 exprimierten Gene der Maus enthält, wurde eine umfassende Expressionsanalyse durchgeführt. Zur Bestätigung der Microarray-Daten und Quantifizierung der Ergebnisse wurde eine Real-Time PCR von ausgewählten Sequenzen durchgeführt. Dabei konnten mehrere hundert Gene identifiziert werden, die in den verschiedenen Prion-infizierten Zelllinien im Vergleich zu nicht infizierten Zellen unterschiedlich exprimiert werden. Prion-infizierte N2a- und GT1-Zellen zeigten Zelltyp-spezifische Veränderungen im RNA-Profil und unterschieden sich beide von beschriebenen Veränderungen in humanen Mikroglia-Zellen und Prion-infiziertem Gehirn, wenn auch mit einigen Überschneidungen. Einige der beobachteten Veränderungen in der Genexpression sind überdies bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie z. B. der Alzheimer Erkrankung beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, dass Prion-Infektionen in ihren Auswirkungen auf die Genexpression vom Zelltyp abhängen, was möglicherweise für diagnostische oder therapeutische Interventionen genutzt werden könnte.