FORPRION

BAYERISCHER FORSCHUNGSVERBUND PRIONEN

TUM 16 Entwicklung spezifischer rekombinanter anti-PrPSc Antikörper

Arbeitsfeld:

Ziel des Projektes war die Produktion von rekombinanten Antikörpern, die eine Unterscheidung zwischen dem zellulären Prion-Protein (PrPC) und dessen pathogener Isoform (PrPSc) gestatten. Um a priori in der Fachwelt bekannte Limitationen konventioneller Antikörpersynthesen, z.B. über Hybridomtechnologie auszuschließen, wurde ein in vitro–Ansatz zur Herstellung von Antikörperfragmenten verfolgt (singlechain fragment variable; scFv). Das Immunogen PrPSc wurde aus Hirnmaterial von ,Patienten mit sporadischer Creutzfeldt-Jakob Krankheit (sCJD) extrahiert und aufgereinigt. Anschließend wurden PrP knock-out-Mäuse (PrP0/0) mit PrPSc immunisiert und deren PrPSc-spezifische Immunantwort über einen immunchemischen Test (ELISA) verifiziert. Aus den Milzzellen postiv getesteter, muriner Mäuse wurde mRNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Gene, die für die variablen, Antigen-spezifischen Regionen von Antikörpern codieren, ließen sich nachfolgend über PCR mit Spezies-spezifischen Primern aus dem cDNA-Pool isolieren und amplifizieren. Die Leicht- und Schwerkettencodierenden Antikörpergene wurden danach in zwei PCR-Schritten über einen (Gly4Ser)3-codierenden DNA Linker zusammengefügt. Für die PCR-Protokolle wurden verschiedene Strategien und umfangreiche Optimierungen durchgeführt. Das scFv Repertoire wurde nachfolgend in den (3+3) Phagemid-Vektor pCANTAB-5E kloniert, wobei eine Antikörperbibliothek von 8800 transformierten E. coli TG1 erhalten wurde. Es ist zu erwarten, dass sich diese Bibliothek für die Produktion von PrP-spezifischen Antikörperfragmenten einsetzen läßt.