FORPRION

BAYERISCHER FORSCHUNGSVERBUND PRIONEN

LMU 8 Entwicklung eines Bluttests zur Diagnose von Prionkrankheiten

Arbeitsfeld:

Das Ziel dieses Forschungsprojektes bestand in der Entwicklung neuartiger Methoden der Anreicherung und Amplifikation von PrPSc und der Kombination dieser Verfahren mit einer hochsensitiven Detektionsmethode, um so den Weg zu bereiten für neue diagnostische Tests zum Nachweis von Prionen in Körperflüssigkeiten (insbesondere Blut und Liquor) bei Mensch und Tier. Im Rahmen der ersten Projektphase konnten wir eine hochsensitive einzelpartikelbasierte Nachweismethode, das SIFT-Verfahren (SIFT = “Scanning for intensely fluorescent targets“), hinsichtlich der Messtechnik weiter verfeinern. Mittels der SIFT-Technik konnte eine im Vergleich zu einem ECL-Westernblot ca. 100fach höhere Sensitivität im Nachweis von PrPSc-Aggregaten erreicht werden. Des Weiteren wurden verschiedene biochemische Verfahren zur Reinigung und Anreicherung von PrPSc evaluiert und ein schnelles und zuverlässiges Protokoll etabliert, das eine ca. 100fache Anreicherung erlaubt. Durch die Kombination der SIFT-Technologie mit diesem optimierten Aufreinigungs-Protokoll sowie durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten PrPSonden zusammen mit monoklonalen Antikörpersonden, die mit einem anderen Fluorophor markiert sind, konnten wir u.a. einen Hochdurchsatz-Assay entwickeln für die Suche nach Substanzen, die die Bindung von PrPC an PrPSc-Aggregate hemmen, was dann in einem Parallelprojekt die Identifikation neuartiger Anti-Prion-Wirkstoffe ermöglichte. Zusätzlich zu dem Ansatz einer „klassischen“ biochemischen Anreicherung/Aufreinigung befassten wir uns im Rahmen dieses Projektes intensiv mit der in vitro-Amplifikation von missgefaltetem PrP (PrPres) mit dem Ziel, die molekularen Mechanismen der Prionvermehrung aufzuklären und diesen exponentiellen Amplifikationsmechanismus für diagnostische Zwecke nutzbar zu machen. Mit der Kombination der PMCA- („Protein misfolding cyclic amplification“) Technik mit einer seriellen Passage des Reaktionsansatzes konnten wir hier eine neue Technik entwickeln, die serielle PMCA (sPMCA). Mittels dieser Methode konnten wir zeigen, dass das in der PMCA-Reaktion neu geformte PrPres die Umfaltung von PrPC ebenso effizient katalysiert wie PrPSc aus Scrapie-infizierten Hamstern, was das Vorliegen einer autokatalytischen Fehlfaltungskaskade, wie sie die Prionhypothese postuliert, bestätigt. In der Folge konnten wir die exponentielle Amplifikation in der sPMCA-Reaktion nutzen, um ein Verfahren zur Erzeugung von Prionen in vitro zu etablieren, das Prionen generiert, die von authentischen Prionen hinsichtlich Proteinase K-Resistenz, autokatalytischer Konversionsaktivität und – was von besonderer Bedeutung ist – spezifischer biologischer Infektiosität nicht unterscheidbar sind. Auf der Grundlage einer erzielten Amplifikationsrate > 100000, konnten wir zeigen, dass in der sPMCA-Reaktion neue infektiöse Partikel gebildet werden, und wir konnten – durch Verwendung an Nitrozellulose gekoppelter Prionen als Applikationsform – die scheinbare Diskrepanz zwischen der Menge an neugebildetem PrPres und neugebildeter Infektiosität auflösen, denn wir konnten zeigen, dass dieser Effekt auf Unterschieden in der Größenverteilung von PrP-Aggregaten und den konsekutiven Unterschieden in der biologischen Clearance beruht. Des Weiteren gelang es uns, ein Verfahren zur PMCA-Amplifikation mittels indirekter Ultrabeschallung in geschlossenen multi-well Probenträgern zu entwickeln, was eine wichtige Voraussetzung für den sicheren und effizienten Einsatz des PMCA Verfahrens bei humanen Prionen darstellt. Von besonderer Wichtigkeit ist auch die Tatsache, dass es Saa und Mitarbeitern (2006) gelang, unter Nutzung des von uns beschriebenen sPMCA-Ansatzes und mittels indirekter Ultrabeschallung PrPSc im Blut Scrapie-infizierter Hamster nachzuweisen. Diese Ergebnisse stellen den grundlegenden Beweis dar, dass die sPMCA-Methode erstmals den direkten biochemischen Nachweis von Prionen im Blut ermöglicht. Gegenwärtig arbeiten wir an der Kombination der sPMCA-Amplifikation mit dem SIFTDetektionsverfahren im humanen System, um hierdurch einen synergistischen Effekt hinsichtlich Sensitivität und Zuverlässigkeit des Prion-Nachweises zu erzielen. In diesem Zusammenhang i) optimieren wir die Reaktionsbedingungen für die PMCA mit humanen Prionen aus Blut und Liquor, ii) untersuchen wir den Effekt des Kodon-129-Polymorphismus im menschlichen Prionprotein und den Einfluss verschiedener Prion-Erregerstämme auf die PMCA-Amplification und iii) entwickeln ein sPMCA-Protokoll, das den Einbau von fluoreszenzmarkiertem PrP in neugebildete PrPSc-Aggregate erlaubt, um so die anschließende spezifische Detektion mittels SIFT zu ermöglichen.