FORPRION

BAYERISCHER FORSCHUNGSVERBUND PRIONEN

LMU 5 Analyse humaner and boviner Prionen in Zellkulturen für diagnostische, analytische und therapeutische Ansätze

Arbeitsfeld:

Wir benützen prion-infizierte Zellkultur-Modelle, um die molekulare und zelluläre Biogenese und Pathogenese von Prionen zu studieren, und um neue therapeutische Ansätze gegen Prion-Infektionen zu entwickeln (Schätzl et al., 1997; Gilch et al., 2001, 2003 und 2006; Nunziante et al., 2003 und 2005; Gilch & Schätzl, 2003; Ertmer et al., 2004 und 2007; Tatzelt & Schätzl, 2007). Diese Studien, deren Ziel es zunächst war, hoch empfängliche Zelllinien zu etablieren, die verschiedene Prion-Stämme propagieren, wurden im Rahmen des Projekts erweitert und verbessert. Die Isolierung und Vermehrung einzelner Prion-Stämme in Zellkultur zur molekularen und phänotypischen Charakterisierung, in Analogie zu Standardmethoden für virale und bakterielle Erreger, ist für bestimmte Fragestellungen sehr hilfreich. Wir haben bestehende und neu entwickelte Zellkultur-Systeme verwendet, um unsere diagnostischen, analytischen und therapeutischen Studien zu verbessern. Um eine möglichst hohe Empfänglichkeit der Empfänger-Zellen zu erreichen, wurden Einzelzell-Klonierungen durchgeführt. Der Nachweis von PrPSc wurde durch die Etablierung eines Dot-Blot Verfahrens und eines Immunfluoreszenz-Tests unter PrPSc-spezifischen Bedingungen deutlich erleichtert und verbessert. Speziell diese Immunfluoreszenz-Technik ermöglicht Studien der Prion-Infektion auf Einzelzell-Niveau und kann hilfreich bei der Analyse Prion-Stämmen sein. Da die Überexpression von PrPc die Konversionsrate in empfänglichen Zellen erhöhen und damit die Akkumulation von PrPSc beschleunigen könnte, wurden sowohl ein lentivirales als ein retrovirales Überexpressionssystem erfolgreich etabliert. Die meisten bislang beschriebenen für Prionen empfänglichen Zelllinien sind neuronalen Ursprungs. Neuere Studien zeigten jedoch, dass Prionen auch in nicht-neuronalen Zelltypen propagiert werden können (Vorberg et al., 2004). Deshalb haben wir die Empfänglichkeit von Muskelzellen, neuroendokrinen Zellen, Fibroblasten, Makrophagen und Mikroglia-Zellen für transiente bzw. persistente Prion-Infektion getestet. Besonders aus Experimenten mit neuroendokrinen SS-1 Zellen und den Insulinoma-Linien -HC8 und -TC3 konnten interessante Daten gewonnen werden. Nach Inkubation dieser Zelllinien mit Prion-infiziertem Hirnhomogenat war die endogene PrPc-Expression reduziert. Dies führte zum Abbruch der Prion-Propagation und bietet einen neuartigen „Selbstheilungs-Mechanismus“ in Zellkultur. In Kollaboration mit Prof. E. Wolf (Genzentrum München) wurden Zellkultur-Versuche mit bovinen Fibroblasten, gewonnen aus Föten von PrP0/0- bzw. PrP+/+- Rindern, die mit BSE infiziert werden sollen, gestartet. Die Primärkulturen wurden erfolgreich immortalisiert und die Infektionsversuche mit BSE-haltigem Hirnhomogenat begonnen. Während der letzten Förderungsperiode konnten wir eine neue Klasse von Anti-Prion Substanzen definieren, die mit intrazellulären Signaltransduktionswegen interferieren. Imatinib (Gleevec), ein Tyrosinkinase-Inhibitor, erwies sich als ein extrem effektiver Hemmer der PrPSc-Akkumulation in Zellkultur. Im Gegensatz zu vielen anderen Anti-Prion Substanzen verändert Imatinib die Lokalisation, den Transport oder die biochemischen Eigenschaften von PrPc nicht. Wir fanden hingegen, dass Imatinib die Halbwertszeit von bestehendem PrPSc signifikant reduziert (Ertmer et al., 2004), wahrscheinlich durch die Induktion von Autophagie (Ertmer et al., 2007). Diese Studien werden noch weitergeführt mit neueren und wirksameren Derivaten. Tierversuche, die in Kollaboration mit Prof. M. Klein und Dr. Flechsig (Würzburg) durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass Imatinib die Neuroinvasion von Prionen durch Inhibition der peripheren Prion-Synthese nach peripherer Infektion verzögern kann (Yun et al., 2007; im Druck). Zusammenfassend konnten wir durch die Etablierung innovativer Zellkultur-Modelle neue Ansätze für Therapie, Diagnose und molekularer Analyse von isolierten Prionen aufzeigen. Die Entdeckung des Anti-Prion Effekts von Imatinib und die Charakterisierung des mechanistischen Hintergrunds im Zusammenhang mit Autophagie eröffnen neue Perspektiven zur Therapie von Prion-Erkrankungen.