FORPRION

BAYERISCHER FORSCHUNGSVERBUND PRIONEN

Erl 3 Entwicklung eines hochsensitiven Immunnachweises zur Detektion von ZNS Gewebe unterschiedlicher Tierarten in Lebensmitteln und Kontaminationsgeweben bei der Schlachtung

Arbeitsfeld:

Als wichtigster Übertragungsweg für die bovine spongiforme Encephalopathie (BSE) und die neue Variante der Creutzfeld-Jakob-Krankheit (vCJD) gilt die Aufnahme Prionen haltiger Gewebe infizierter Tiere mit der Nahrung. In erster Linie stellt dabei das Zentrale Nerven System (ZNS), also Gehirn und Rückenmark, Risikomaterial dar, das aus der Nahrungskette ausgeschlossen werden muss. Um diese Maßnahme des vorsorgenden Verbraucherschutzes überprüfen zu können, werden sehr spezifische und empfindliche Analysenmethoden zum Nachweis von ZNS-Gewebe in Lebensmitteln benötigt. Ziel dieses Projektes war es deshalb, ein immunochemisches Nachweisverfahren zu entwickeln, das sehr sicher und empfindlich die Anwesenheit von ZNS-Gewebe in Lebensmitteln anzeigen kann. Das Testsystem sollte zweistufig aufgebaut sein, bestehend aus einer schnellen Screeningmethode und einer hoch zuverlässigen Bestätigungsmethode. Dazu wurde myelinisches Proteolipidprotein (PLP) erstmals als ein hochspezifisches und hitzestabiles Markerprotein identifiziert, welches die Detektion von ZNS-Gewebe in kontaminierten Lebensmitteln erlaubt. Im weiteren Verlauf wurde ein hochselektiver polyklonaler Antikörper hergestellt, der gegen ein Epitop gerichtet ist, das im Gesamtlängen-PLP-Protein, aber nicht in DM-20 vorkommt. DM-20 ist eine entwicklungsregulierte Spleißvariante von PLP, die in peripheren Nerven zu finden ist. Durch seinen extrem hydrophoben Charakter war es möglich, PLP selektiv durch organische Lösungsmittel anzureichern. Der PLP-Antikörper wurde dann für die Entwicklung der immunochemischen Testverfahren eingesetzt. Zunächst wurde ein Western Blot Test entwickelt um ZNS-Gewebe in Fleisch nachzuweisen. Als Screeningmethode wurde weiterhin ein Dot Blot Test unter Verwendung des PLP-Antikörpers konzipiert. Dieser zeichnet sich gegenüber dem Western Blot durch eine erheblich einfachere und schnellere Handhabung und eine visuelle Auswertung aus. Das gesamte Verfahren zeigte eine ausgezeichnete Gewebeselektivität. Während Rückenmark und Gehirn verschiedener Säuger zuverlässig erkannt werden, stören andere Gewebe nicht, wie zum Beispiel periphere Nerven, die legale Bestandteile von Fleischerzeugnissen darstellen. Durch Auswahl eines hitzestabilen Epitops konnten ZNS-Kontaminationen in allen untersuchten Wurstsorten detektiert werden. Die Nach¬weisgrenze des Western Blot Verfahrens lag unter 0,025 % ZNS-Gewebe in Fleisch, wobei der Test eine sehr gute Linearität aufwies, so dass er auch zur Quantifizierung von ZNS-Kontaminationen herangezogen werden kann. In verschiedenen Wurstsorten konnten bis unter 0,1 % Gehirn oder Rückenmark, das vor der Herstellung zugegeben worden war, zuverlässig nachgewiesen werden. Die Nachweisgrenze des Dot Blot Verfahrens konnte auf 0,01 % ZNS-Gewebe in Fleisch gesenkt werden, was einen Einsatz als vorgeschaltete Screeningmethode erlaubt. Der Dot Blot Test lässt sich weiterhin mit einem Wischtest kombinieren, so dass auch ZNS-Kontaminationen auf Fleisch und Arbeitsflächen, die während des Schlachtprozesses auftreten, bis hinunter zu einer Menge von 0,5 mg sicher nachweisbar sind. Der neuentwickelte ZNS-Western Blot wurde dann in einer Reihenuntersuchung eingesetzt, in der 152 repräsentative Wurstproben aus dem Bayerischen Handel getestet wurden. Knapp 10 % der Proben zeigten ein positives Testergebnis. Sowohl die Menge an nachgewiesenem ZNS, als auch das Ergebnis von Nachuntersuchungen zeigte, dass in einigen Fällen ZNS-Gewebe, höchst wahrscheinlich Gehirn, als mengenmäßig relevante Zutat für die Herstellung von Wurst verwendet wurde. Das neu entwickelte zweistufige Testsystem erlaubt somit einen zuverlässigen und hoch sensitiven Nachweis von ZNS Kontaminationen in Fleischprodukten und ist nun sowohl in der amtlichen als auch privaten Lebensmittelüberwachung einsetzbar.